近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和衛(wèi)生意識(shí)的增強(qiáng)，消毒劑的使用越來(lái)越普遍，尤其是在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和藥品生產(chǎn)行業(yè)。2010年版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP)規(guī)定對(duì)廠房、潔凈區(qū)、排水系統(tǒng)、設(shè)備等清潔后需進(jìn)行必要的消毒處理,并且設(shè)備消毒需規(guī)定消毒的具體方法、消毒劑的名稱和配制方法。但是GMP法規(guī)至今沒(méi)有對(duì)制藥企業(yè)消毒劑管理作詳細(xì)規(guī)定，筆者結(jié)合自身在藥企的工作心得和醫(yī)療系統(tǒng)相關(guān)法規(guī)要求，從液體消毒劑遴選原則和消毒效果驗(yàn)證方法兩個(gè)方面，探討液體消毒劑驗(yàn)證管理在制藥企業(yè)中的應(yīng)用，為制藥企業(yè)的消毒劑管理提供參考。
1、液體消毒劑的概念和遴選原則
液體消毒劑是指某些能夠起到殺滅病原微生物并達(dá)到消毒要求的液體制劑。優(yōu)質(zhì)的液體消毒劑應(yīng)具備殺死多種病原微生物、消毒能力強(qiáng)、作用迅速、無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)腐蝕、無(wú)刺激,對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害,對(duì)環(huán)境污染程度低等特點(diǎn)。醫(yī)院外科手術(shù)最早使用的消毒藥水一石碳酸，是由英國(guó)外科醫(yī)生李斯特在調(diào)查污水溝里長(zhǎng)滿水草和浮萍的原因時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的。此后,漂******、戊二醛、苯扎氯銨、碘酊和乙醇等一系列液體消毒劑相繼被發(fā)現(xiàn)。液體消毒劑在制藥企業(yè)主要應(yīng)用于廠房環(huán)境消毒、手消毒和生產(chǎn)設(shè)備清潔后消毒等方面。
液體消毒劑的遴選原則。
一是遴選依據(jù),2010年版GMP并未對(duì)液體消毒劑的遴選做詳細(xì)的規(guī)定，但為確保藥品生產(chǎn)環(huán)境、人員衛(wèi)生符合無(wú)菌要求以防止其對(duì)藥品造成污染，制藥企業(yè)的液體消毒劑遴選主要參考了《醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生規(guī)范》（2009)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》（2012)。
二是遴選類別,應(yīng)當(dāng)選用目前醫(yī)藥企業(yè)內(nèi)部普遍接受并已證明有效的消毒劑類別。
三是消毒劑的生產(chǎn)廠家，必須是獲得國(guó)務(wù)院或省級(jí)衛(wèi)生行政管理生產(chǎn)許可、并持有生產(chǎn)許可證的廠家。
第四是消毒劑產(chǎn)品的外包裝,必須標(biāo)明品名、廠名、生產(chǎn)批號(hào)、有效期、批準(zhǔn)文號(hào)、有效成分、有效濃度和使用方法等信息。
2、液體消毒劑的驗(yàn)證管理
驗(yàn)證是指證明按照預(yù)先設(shè)定的操作規(guī)范、工藝或方法能夠生產(chǎn)出滿足預(yù)期結(jié)果或者達(dá)到相應(yīng)法規(guī)要求產(chǎn)品的一系列活動(dòng)。2010年版GMP第143條規(guī)定制藥企業(yè)的清潔方法驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)當(dāng)綜合考慮清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置等內(nèi)容,證實(shí)清潔的效果,有效防止污染和交叉污染的發(fā)生；并于2015年頒發(fā)了附錄11對(duì)相關(guān)內(nèi)容做了詳細(xì)規(guī)定。但是對(duì)于消毒劑的選擇和消毒效果的驗(yàn)證并無(wú)明確的規(guī)定。為了確保液體消毒劑在制藥企業(yè)日常生產(chǎn)中的消毒效果，規(guī)范其日常管理，使其有效、有序地開(kāi)展，筆者結(jié)合多年來(lái)在制藥企業(yè)的工作經(jīng)驗(yàn)建議從以下幾個(gè)方面來(lái)開(kāi)展驗(yàn)證工作。
2.1消毒劑有效成分含量的測(cè)定消毒劑的有效成分是指消毒劑中對(duì)細(xì)菌孢子、繁殖體、真菌、病毒等具有殺滅作用的成分,決定消毒劑消毒效果的強(qiáng)弱。常見(jiàn)的方法有比重法、相對(duì)密度測(cè)定法和儀器分析法（如色譜、光學(xué)和電化學(xué)分析方法）。比重法主要用于僅由水和乙醇組成的消毒劑，如75%乙醇和95%乙醇的配制。相對(duì)密度法常用于異丙醇消毒液的配制，如68%異丙醇和70%異丙醇消毒液的配制。而儀器分析法一般用于復(fù)方消毒產(chǎn)品的含量測(cè)定。
2.2消毒劑消毒能力的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)消毒劑消毒能力的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)一般選用待評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)某一代表性微生物的最低使用濃度或企業(yè)常用濃度為實(shí)驗(yàn)濃度；以說(shuō)明書(shū)規(guī)定最短作用時(shí)間的0.5,1.0和1.5倍為實(shí)驗(yàn)時(shí)間；采用的評(píng)價(jià)方法包括中和劑實(shí)驗(yàn)法和定量殺菌實(shí)驗(yàn)法。
2.2.1中和劑實(shí)驗(yàn)法中和劑是指既能有效抑制消毒劑殺菌能力又不削弱微生物活力的試劑，可準(zhǔn)確反映使用中消毒劑受微生物污染的狀況[2],所有消毒劑在使用之前都需做本項(xiàng)檢測(cè)。中和劑檢測(cè)中所用的菌種有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌和大腸埃希菌，使用之前都需經(jīng)過(guò)菌種鑒定。首先，配制實(shí)驗(yàn)方案所需濃度的消毒劑、中和劑和實(shí)驗(yàn)菌株；其次，將實(shí)驗(yàn)分成中和劑毒性組（Nc,用于檢測(cè)中和劑對(duì)微生物的抑制/殺滅作用）、中和產(chǎn)物組（Nt,驗(yàn)證中和劑與消毒劑適當(dāng)比例混合后產(chǎn)物對(duì)微生物的抑制/殺滅作用）、空白對(duì)照組（No,驗(yàn)證無(wú)中和劑/消毒劑條件下反應(yīng)液中的微生物數(shù)量），并按方案要求制備得到相應(yīng)的反應(yīng)液萬(wàn)方數(shù)將各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液涂于無(wú)菌培養(yǎng)液上培養(yǎng)一段時(shí)間后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取兩個(gè)合適濃度梯度(都應(yīng)處在30~300cfu之間）平板計(jì)數(shù)，分別計(jì)為a和a1,然后按下式計(jì)算：
d為溶液稀釋倍數(shù),Nc、Nt和No分別代表中和劑組、中和產(chǎn)物組和空白對(duì)照組中菌落數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)-0.3≤No-Nc≤0.3且-0.3≤No-Nt≤0.3時(shí),表明中和劑對(duì)消毒劑具有很好的中和作用,但對(duì)細(xì)菌恢復(fù)培養(yǎng)無(wú)影響，即認(rèn)為通過(guò)實(shí)驗(yàn)。
2.2.2定量殺菌實(shí)驗(yàn)定量殺菌實(shí)驗(yàn)是指用消毒劑殺滅懸浮液中一定劑量的細(xì)菌繁殖體和孢子，以評(píng)價(jià)消毒劑的消毒效果。常用的方法有懸液定量法和載體噴霧定量法，其中載體噴霧定量法適用于不宜用懸液定量法評(píng)價(jià)的消毒劑,如黏稠的消毒劑和沖洗消毒的消毒劑。
懸液定量法：首先，可配制一定濃度（如濃度為10^9cfu·mL^-1)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和白念珠菌的實(shí)驗(yàn)菌液。吸取各菌液10μL均勻涂布于已消毒滅菌的不銹鋼板上,層流吹干。其次,選取消毒劑使用說(shuō)明書(shū)上的最低濃度以3個(gè)不同作用時(shí)間（說(shuō)明書(shū)規(guī)定最短作用時(shí)間的0.5,1.0和1.5倍)對(duì)平板進(jìn)行消毒,平行做對(duì)照實(shí)驗(yàn)（以0.9%氯化鈉溶液代替消毒劑）。第三,將實(shí)驗(yàn)組（Kl)和對(duì)照組（Kc)進(jìn)行取樣,取樣液涂布于無(wú)菌培養(yǎng)液上培養(yǎng)一段時(shí)間,檢測(cè)各種菌的生長(zhǎng)狀況,計(jì)算菌落數(shù)（N),從而評(píng)價(jià)消毒劑的消毒效果。
載體噴霧定量殺菌實(shí)驗(yàn):首先,配制一定濃度（如10^9cfu·mL^-1)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希囷和白念珠囷的實(shí)驗(yàn)囷液。其次,分別取3片每種標(biāo)準(zhǔn)菌染后菌片以等邊三角形陣列形式均勻排布于一個(gè)無(wú)菌玻璃板上。第三,用同一濃度消毒劑溶液均勻噴灑于上述菌片上,但不能使菌片濕透和流液。第四,待消毒劑與菌片作用一段時(shí)間后,將每個(gè)菌片分別放人一個(gè)無(wú)菌試管內(nèi),加人一定量中和劑渦旋20s,使細(xì)菌洗脫人中和液中。吸取洗液1.0mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿（每管2個(gè)皿）中培養(yǎng)一段時(shí)間后計(jì)算菌落數(shù)(Nk)。以制藥用水為對(duì)照組做平行實(shí)驗(yàn)（Nc)。計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值(KL)：
Log10Ne和Log10Nk分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)KL≥3時(shí)表明滅菌效果符合標(biāo)準(zhǔn)。
2.3消毒效果的現(xiàn)場(chǎng)或模擬現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)現(xiàn)場(chǎng)或模擬現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)消毒劑在實(shí)際使用條件下的消毒效果，主要包括潔凈區(qū)表面和手消毒兩個(gè)方面，原則上選擇類似物品中最難達(dá)到消毒合格的部位（如手的五指屈面），但是對(duì)于特指消毒對(duì)象時(shí)應(yīng)選擇該特指對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用消毒劑濃度和時(shí)間一般為產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)規(guī)定的最低使用濃度和最短作用時(shí)間。
2.3.1消毒劑對(duì)潔凈區(qū)表面消毒模擬實(shí)驗(yàn)?zāi)M實(shí)驗(yàn)對(duì)象應(yīng)選擇常用的材質(zhì)載體,如彩砂、環(huán)氧地坪、不銹鋼、彩鋼板、聚氯乙烯、玻璃、硅膠、塑料薄膜等；實(shí)驗(yàn)菌種與評(píng)價(jià)的消毒劑有關(guān)，如殺孢子劑選擇枯草芽孢桿菌,而一般消毒劑可選用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白念珠菌等。具體步驟如下:首先,準(zhǔn)備6cmx6cm的各材質(zhì)載體（除塑料薄膜)5塊（實(shí)驗(yàn)組3塊、對(duì)照組和空白對(duì)照組各1塊）。實(shí)驗(yàn)前清洗并進(jìn)行濕熱滅菌后密封傳遞至潔凈操作區(qū)。其次，在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組每塊平面載體上滴加標(biāo)準(zhǔn)菌種菌懸液(10^7?10^8cfu-mL-l)0.1mL,并用接種環(huán)平均涂抹于約5cmx5cm的方形面積內(nèi)后晾干。對(duì)實(shí)驗(yàn)組已接種過(guò)的平面載體噴灑消毒劑,噴灑應(yīng)無(wú)死角，待消毒劑達(dá)到指定作用時(shí)間時(shí)，對(duì)3塊平面載體進(jìn)行取樣。對(duì)照組和空白對(duì)照組不做處理，直接擦拭取樣。第三，分別取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組樣品1mL與4mL中和劑混合一定時(shí)間后，取1mL接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿上,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為:空白對(duì)照組菌落數(shù)為0,實(shí)驗(yàn)組有少量或無(wú)菌落生長(zhǎng),對(duì)照組有大量菌落生長(zhǎng)；且所有樣本的殺滅對(duì)數(shù)值均為3.00,可判為消毒合格。
2.3.2潔凈區(qū)手消毒效果驗(yàn)證手消毒是人員在潔凈區(qū)內(nèi)最頻繁的操作步驟，消毒效果的好壞對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境的維持以及無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量的保證至關(guān)重要。因此,消毒劑正式投人使用前進(jìn)行手消毒效果驗(yàn)證十分重要。具體步驟如下:首先,選擇3名裸手受試者，先噴灑0.9%氯化鈉溶液,雙手摩擦20s后用無(wú)菌棉簽進(jìn)行擦拭取樣。將取樣棉簽與手接觸部位剪去置于0.9%氯化鈉溶液10mL中作為對(duì)照樣品。其次,對(duì)手進(jìn)行無(wú)死角噴灑消毒，1min后用棉簽擦拭取樣作為實(shí)驗(yàn)組樣品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中擦拭力度、棉簽大小和吸取的采樣液應(yīng)保持一致。第三,分別取1mL實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液）樣品與中和劑4mL混合一定時(shí)間后，各取1mL接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿上,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為空白對(duì)照組菌落數(shù)為0,實(shí)驗(yàn)組有少量或無(wú)菌落生長(zhǎng),而對(duì)照組有大量菌落生長(zhǎng)；且各樣本平均殺滅對(duì)數(shù)值為1.00可判為消毒合格。
2.4儲(chǔ)存期限驗(yàn)證消毒劑存儲(chǔ)期限的驗(yàn)證主要包括外觀檢查、有效殺菌成分含量測(cè)定和微生物測(cè)定。首先，按照消毒劑使用說(shuō)明書(shū)和保存期限要求配制適當(dāng)液體消毒劑,存儲(chǔ)于規(guī)定容器中。其次,在保存期限前后和當(dāng)天分別取樣，檢測(cè)外觀應(yīng)無(wú)顏色變化,無(wú)沉淀和懸浮物；有效殺菌成分的含量應(yīng)不低于產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的最低有效濃度；且消毒劑溶液中應(yīng)無(wú)微生物存在。
隨著液體消毒劑技術(shù)的不斷發(fā)展和制藥企業(yè)GMP管理推行的不斷深人，作為藥品生產(chǎn)過(guò)程中廠房環(huán)境、設(shè)備和人員消毒必不可少的液體消毒劑種類將會(huì)越來(lái)越多,其使用和管理將引起人們的普遍關(guān)注。制定液體消毒劑消毒效果的驗(yàn)證管理規(guī)程不僅可以規(guī)范其使用程序和確保消毒效果,而且又是確保藥品生產(chǎn)環(huán)境的穩(wěn)定和無(wú)菌，保證藥品質(zhì)量和用藥安全,以防污染和交叉污染產(chǎn)生的重要措施。
近年來(lái)，隨著人們生活水平的提高和衛(wèi)生意識(shí)的增強(qiáng)，消毒劑的使用越來(lái)越普遍，尤其是在食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生和藥品生產(chǎn)行業(yè)。2010年版《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP)規(guī)定對(duì)廠房、潔凈區(qū)、排水系統(tǒng)、設(shè)備等清潔后需進(jìn)行必要的消毒處理,并且設(shè)備消毒需規(guī)定消毒的具體方法、消毒劑的名稱和配制方法。但是GMP法規(guī)至今沒(méi)有對(duì)制藥企業(yè)消毒劑管理作詳細(xì)規(guī)定，筆者結(jié)合自身在藥企的工作心得和醫(yī)療系統(tǒng)相關(guān)法規(guī)要求，從液體消毒劑遴選原則和消毒效果驗(yàn)證方法兩個(gè)方面，探討液體消毒劑驗(yàn)證管理在制藥企業(yè)中的應(yīng)用，為制藥企業(yè)的消毒劑管理提供參考。
1、液體消毒劑的概念和遴選原則
液體消毒劑是指某些能夠起到殺滅病原微生物并達(dá)到消毒要求的液體制劑。優(yōu)質(zhì)的液體消毒劑應(yīng)具備殺死多種病原微生物、消毒能力強(qiáng)、作用迅速、無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)腐蝕、無(wú)刺激,對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害,對(duì)環(huán)境污染程度低等特點(diǎn)。醫(yī)院外科手術(shù)最早使用的消毒藥水一石碳酸，是由英國(guó)外科醫(yī)生李斯特在調(diào)查污水溝里長(zhǎng)滿水草和浮萍的原因時(shí)意外發(fā)現(xiàn)的。此后,漂******、戊二醛、苯扎氯銨、碘酊和乙醇等一系列液體消毒劑相繼被發(fā)現(xiàn)。液體消毒劑在制藥企業(yè)主要應(yīng)用于廠房環(huán)境消毒、手消毒和生產(chǎn)設(shè)備清潔后消毒等方面。
液體消毒劑的遴選原則。
一是遴選依據(jù),2010年版GMP并未對(duì)液體消毒劑的遴選做詳細(xì)的規(guī)定，但為確保藥品生產(chǎn)環(huán)境、人員衛(wèi)生符合無(wú)菌要求以防止其對(duì)藥品造成污染，制藥企業(yè)的液體消毒劑遴選主要參考了《醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生規(guī)范》（2009)和《醫(yī)療機(jī)構(gòu)消毒技術(shù)規(guī)范》（2012)。
二是遴選類別,應(yīng)當(dāng)選用目前醫(yī)藥企業(yè)內(nèi)部普遍接受并已證明有效的消毒劑類別。
三是消毒劑的生產(chǎn)廠家，必須是獲得國(guó)務(wù)院或省級(jí)衛(wèi)生行政管理生產(chǎn)許可、并持有生產(chǎn)許可證的廠家。
第四是消毒劑產(chǎn)品的外包裝,必須標(biāo)明品名、廠名、生產(chǎn)批號(hào)、有效期、批準(zhǔn)文號(hào)、有效成分、有效濃度和使用方法等信息。
2、液體消毒劑的驗(yàn)證管理
驗(yàn)證是指證明按照預(yù)先設(shè)定的操作規(guī)范、工藝或方法能夠生產(chǎn)出滿足預(yù)期結(jié)果或者達(dá)到相應(yīng)法規(guī)要求產(chǎn)品的一系列活動(dòng)。2010年版GMP第143條規(guī)定制藥企業(yè)的清潔方法驗(yàn)證過(guò)程中應(yīng)當(dāng)綜合考慮清潔劑和消毒劑、取樣方法和位置等內(nèi)容,證實(shí)清潔的效果,有效防止污染和交叉污染的發(fā)生；并于2015年頒發(fā)了附錄11對(duì)相關(guān)內(nèi)容做了詳細(xì)規(guī)定。但是對(duì)于消毒劑的選擇和消毒效果的驗(yàn)證并無(wú)明確的規(guī)定。為了確保液體消毒劑在制藥企業(yè)日常生產(chǎn)中的消毒效果，規(guī)范其日常管理，使其有效、有序地開(kāi)展，筆者結(jié)合多年來(lái)在制藥企業(yè)的工作經(jīng)驗(yàn)建議從以下幾個(gè)方面來(lái)開(kāi)展驗(yàn)證工作。
2.1消毒劑有效成分含量的測(cè)定消毒劑的有效成分是指消毒劑中對(duì)細(xì)菌孢子、繁殖體、真菌、病毒等具有殺滅作用的成分,決定消毒劑消毒效果的強(qiáng)弱。常見(jiàn)的方法有比重法、相對(duì)密度測(cè)定法和儀器分析法（如色譜、光學(xué)和電化學(xué)分析方法）。比重法主要用于僅由水和乙醇組成的消毒劑，如75%乙醇和95%乙醇的配制。相對(duì)密度法常用于異丙醇消毒液的配制，如68%異丙醇和70%異丙醇消毒液的配制。而儀器分析法一般用于復(fù)方消毒產(chǎn)品的含量測(cè)定。
2.2消毒劑消毒能力的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)消毒劑消毒能力的實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)一般選用待評(píng)價(jià)消毒劑對(duì)某一代表性微生物的最低使用濃度或企業(yè)常用濃度為實(shí)驗(yàn)濃度；以說(shuō)明書(shū)規(guī)定最短作用時(shí)間的0.5,1.0和1.5倍為實(shí)驗(yàn)時(shí)間；采用的評(píng)價(jià)方法包括中和劑實(shí)驗(yàn)法和定量殺菌實(shí)驗(yàn)法。
2.2.1中和劑實(shí)驗(yàn)法中和劑是指既能有效抑制消毒劑殺菌能力又不削弱微生物活力的試劑，可準(zhǔn)確反映使用中消毒劑受微生物污染的狀況[2],所有消毒劑在使用之前都需做本項(xiàng)檢測(cè)。中和劑檢測(cè)中所用的菌種有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌和大腸埃希菌，使用之前都需經(jīng)過(guò)菌種鑒定。首先，配制實(shí)驗(yàn)方案所需濃度的消毒劑、中和劑和實(shí)驗(yàn)菌株；其次，將實(shí)驗(yàn)分成中和劑毒性組（Nc,用于檢測(cè)中和劑對(duì)微生物的抑制/殺滅作用）、中和產(chǎn)物組（Nt,驗(yàn)證中和劑與消毒劑適當(dāng)比例混合后產(chǎn)物對(duì)微生物的抑制/殺滅作用）、空白對(duì)照組（No,驗(yàn)證無(wú)中和劑/消毒劑條件下反應(yīng)液中的微生物數(shù)量），并按方案要求制備得到相應(yīng)的反應(yīng)液萬(wàn)方數(shù)將各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液涂于無(wú)菌培養(yǎng)液上培養(yǎng)一段時(shí)間后,每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取兩個(gè)合適濃度梯度(都應(yīng)處在30~300cfu之間）平板計(jì)數(shù)，分別計(jì)為a和a1,然后按下式計(jì)算：
d為溶液稀釋倍數(shù),Nc、Nt和No分別代表中和劑組、中和產(chǎn)物組和空白對(duì)照組中菌落數(shù)。判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)-0.3≤No-Nc≤0.3且-0.3≤No-Nt≤0.3時(shí),表明中和劑對(duì)消毒劑具有很好的中和作用,但對(duì)細(xì)菌恢復(fù)培養(yǎng)無(wú)影響，即認(rèn)為通過(guò)實(shí)驗(yàn)。
2.2.2定量殺菌實(shí)驗(yàn)定量殺菌實(shí)驗(yàn)是指用消毒劑殺滅懸浮液中一定劑量的細(xì)菌繁殖體和孢子，以評(píng)價(jià)消毒劑的消毒效果。常用的方法有懸液定量法和載體噴霧定量法，其中載體噴霧定量法適用于不宜用懸液定量法評(píng)價(jià)的消毒劑,如黏稠的消毒劑和沖洗消毒的消毒劑。
懸液定量法：首先，可配制一定濃度（如濃度為10^9cfu·mL^-1)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌和白念珠菌的實(shí)驗(yàn)菌液。吸取各菌液10μL均勻涂布于已消毒滅菌的不銹鋼板上,層流吹干。其次,選取消毒劑使用說(shuō)明書(shū)上的最低濃度以3個(gè)不同作用時(shí)間（說(shuō)明書(shū)規(guī)定最短作用時(shí)間的0.5,1.0和1.5倍)對(duì)平板進(jìn)行消毒,平行做對(duì)照實(shí)驗(yàn)（以0.9%氯化鈉溶液代替消毒劑）。第三,將實(shí)驗(yàn)組（Kl)和對(duì)照組（Kc)進(jìn)行取樣,取樣液涂布于無(wú)菌培養(yǎng)液上培養(yǎng)一段時(shí)間,檢測(cè)各種菌的生長(zhǎng)狀況,計(jì)算菌落數(shù)（N),從而評(píng)價(jià)消毒劑的消毒效果。
載體噴霧定量殺菌實(shí)驗(yàn):首先,配制一定濃度（如10^9cfu·mL^-1)的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希囷和白念珠囷的實(shí)驗(yàn)囷液。其次,分別取3片每種標(biāo)準(zhǔn)菌染后菌片以等邊三角形陣列形式均勻排布于一個(gè)無(wú)菌玻璃板上。第三,用同一濃度消毒劑溶液均勻噴灑于上述菌片上,但不能使菌片濕透和流液。第四,待消毒劑與菌片作用一段時(shí)間后,將每個(gè)菌片分別放人一個(gè)無(wú)菌試管內(nèi),加人一定量中和劑渦旋20s,使細(xì)菌洗脫人中和液中。吸取洗液1.0mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿（每管2個(gè)皿）中培養(yǎng)一段時(shí)間后計(jì)算菌落數(shù)(Nk)。以制藥用水為對(duì)照組做平行實(shí)驗(yàn)（Nc)。計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值(KL)：
Log10Ne和Log10Nk分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值。判定標(biāo)準(zhǔn)為：當(dāng)KL≥3時(shí)表明滅菌效果符合標(biāo)準(zhǔn)。
2.3消毒效果的現(xiàn)場(chǎng)或模擬現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)現(xiàn)場(chǎng)或模擬現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)消毒劑在實(shí)際使用條件下的消毒效果，主要包括潔凈區(qū)表面和手消毒兩個(gè)方面，原則上選擇類似物品中最難達(dá)到消毒合格的部位（如手的五指屈面），但是對(duì)于特指消毒對(duì)象時(shí)應(yīng)選擇該特指對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用消毒劑濃度和時(shí)間一般為產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)規(guī)定的最低使用濃度和最短作用時(shí)間。
2.3.1消毒劑對(duì)潔凈區(qū)表面消毒模擬實(shí)驗(yàn)?zāi)M實(shí)驗(yàn)對(duì)象應(yīng)選擇常用的材質(zhì)載體,如彩砂、環(huán)氧地坪、不銹鋼、彩鋼板、聚氯乙烯、玻璃、硅膠、塑料薄膜等；實(shí)驗(yàn)菌種與評(píng)價(jià)的消毒劑有關(guān)，如殺孢子劑選擇枯草芽孢桿菌,而一般消毒劑可選用金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白念珠菌等。具體步驟如下:首先,準(zhǔn)備6cmx6cm的各材質(zhì)載體（除塑料薄膜)5塊（實(shí)驗(yàn)組3塊、對(duì)照組和空白對(duì)照組各1塊）。實(shí)驗(yàn)前清洗并進(jìn)行濕熱滅菌后密封傳遞至潔凈操作區(qū)。其次，在實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組每塊平面載體上滴加標(biāo)準(zhǔn)菌種菌懸液(10^7?10^8cfu-mL-l)0.1mL,并用接種環(huán)平均涂抹于約5cmx5cm的方形面積內(nèi)后晾干。對(duì)實(shí)驗(yàn)組已接種過(guò)的平面載體噴灑消毒劑,噴灑應(yīng)無(wú)死角，待消毒劑達(dá)到指定作用時(shí)間時(shí)，對(duì)3塊平面載體進(jìn)行取樣。對(duì)照組和空白對(duì)照組不做處理，直接擦拭取樣。第三，分別取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組樣品1mL與4mL中和劑混合一定時(shí)間后，取1mL接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿上,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為:空白對(duì)照組菌落數(shù)為0,實(shí)驗(yàn)組有少量或無(wú)菌落生長(zhǎng),對(duì)照組有大量菌落生長(zhǎng)；且所有樣本的殺滅對(duì)數(shù)值均為3.00,可判為消毒合格。
2.3.2潔凈區(qū)手消毒效果驗(yàn)證手消毒是人員在潔凈區(qū)內(nèi)最頻繁的操作步驟，消毒效果的好壞對(duì)潔凈區(qū)環(huán)境的維持以及無(wú)菌產(chǎn)品質(zhì)量的保證至關(guān)重要。因此,消毒劑正式投人使用前進(jìn)行手消毒效果驗(yàn)證十分重要。具體步驟如下:首先,選擇3名裸手受試者，先噴灑0.9%氯化鈉溶液,雙手摩擦20s后用無(wú)菌棉簽進(jìn)行擦拭取樣。將取樣棉簽與手接觸部位剪去置于0.9%氯化鈉溶液10mL中作為對(duì)照樣品。其次,對(duì)手進(jìn)行無(wú)死角噴灑消毒，1min后用棉簽擦拭取樣作為實(shí)驗(yàn)組樣品。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中擦拭力度、棉簽大小和吸取的采樣液應(yīng)保持一致。第三,分別取1mL實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空白對(duì)照組(0.9%氯化鈉溶液）樣品與中和劑4mL混合一定時(shí)間后，各取1mL接種于無(wú)菌培養(yǎng)皿上,置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),統(tǒng)計(jì)菌落數(shù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)為空白對(duì)照組菌落數(shù)為0,實(shí)驗(yàn)組有少量或無(wú)菌落生長(zhǎng),而對(duì)照組有大量菌落生長(zhǎng)；且各樣本平均殺滅對(duì)數(shù)值為1.00可判為消毒合格。
2.4儲(chǔ)存期限驗(yàn)證消毒劑存儲(chǔ)期限的驗(yàn)證主要包括外觀檢查、有效殺菌成分含量測(cè)定和微生物測(cè)定。首先，按照消毒劑使用說(shuō)明書(shū)和保存期限要求配制適當(dāng)液體消毒劑,存儲(chǔ)于規(guī)定容器中。其次,在保存期限前后和當(dāng)天分別取樣，檢測(cè)外觀應(yīng)無(wú)顏色變化,無(wú)沉淀和懸浮物；有效殺菌成分的含量應(yīng)不低于產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的最低有效濃度；且消毒劑溶液中應(yīng)無(wú)微生物存在。
隨著液體消毒劑技術(shù)的不斷發(fā)展和制藥企業(yè)GMP管理推行的不斷深人，作為藥品生產(chǎn)過(guò)程中廠房環(huán)境、設(shè)備和人員消毒必不可少的液體消毒劑種類將會(huì)越來(lái)越多,其使用和管理將引起人們的普遍關(guān)注。制定液體消毒劑消毒效果的驗(yàn)證管理規(guī)程不僅可以規(guī)范其使用程序和確保消毒效果,而且又是確保藥品生產(chǎn)環(huán)境的穩(wěn)定和無(wú)菌，保證藥品質(zhì)量和用藥安全,以防污染和交叉污染產(chǎn)生的重要措施。
